狗狗肾上腺什么毛病？
肾上腺皮质激素是由动物体内肾上腺分泌产生的一类甾体激素，对维持机体的正常代谢、免疫应答及神经系统功能起重要调节作用。目前，已有15种肾上腺糖皮质激素被报道具有潜在的抗犬冠状病毒（Canine coronavirus， CCV）效果[1]，但由于其分子结构相似度较高且缺乏特异性抗原表位，单一糖皮质激素不能达到理想的抗病毒治疗效果 [2-3] ，因此常采用联合用药的方式增强疗效并缩短病程。 本研究在前期工作的基础上，通过体外感染试验评价了地塞米松与氟尼辛葡甲胺联用对CCV的抑制作用；通过ELISA和RT-PCR方法初步研究了联用方案对病毒复制的影响及其可能的作用机制，为临床治疗提供参考依据。
一、材料与方法 (一) 主要仪器与试剂
1. 实验动物 70日龄健康杂交狗48只，雄雌各半，体重(9~11)kg;由江苏省农业科学院动物医学研究所提供并于饲养环境中隔离观察1周以上，观察期间未出现异常症状，无疾病史记录；
2. 主要试剂 地塞米松磷酸钠(Dexamethasone phosphate， Dex)购自中国北京协和制药厂(进口分装，批号H31020603);氟尼辛葡甲胺(Flunixin meglumine， FML)购自上海普洛麦格药业有限公司(批号1208FJ02S)；
CCV标准株A12/HK-98由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王益涛教授惠赠;鸡胚培养基、鸡卵黄液均购自中国科学院动物研究所;普通鸡胚(9~10 d龄)、SPF鸡卵母细胞、胰蛋白酶溶液购自上海吉玛制药技术有限公司;PBS缓冲液、Tris碱、氯仿、异丙醇等均为分析纯级产品；山羊抗犬IgG二抗和羊抗山羊IgG三抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；荧光显微镜(BX51，OLYMPUS)用于观察病毒感染情况;全自动酶标仪(Multi SKAN MK III， TECAN)用于检测血清抗体水平;RNA提取试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM PCR Kit购自宝生物工程(大连)有限公司 ;BioRad CFX96 Real Time System用于定量扩增; 其他相关化学原料均为国产分析纯。
（二）实验方法
1. 动物分组 将48只健康杂交狗随机分为对照组、阳性药物组和药物联用组，每组各12只。其中，对照组不给予任何处理措施，阳性药物组给予阳性药FML(3 mg/kg·bw)肌肉注射，每天1次，连续3天;药物联用组在给予阳性药的基础上再按0.38 mg/kg·bw剂量皮下注射地塞米松磷酸钠，每天一次，连续3天。
2. 病毒感染复制模型建立 参照文献[4]进行。取CCV标准毒株A12/HK‐98 5×106 TCID50接种9~10日龄鸡胚尿囊腔，37℃静置培养72 h后收取鸡胚尿囊液(CEV)，5 000 r/min离心5 min，去除蛋浆沉淀备用。
3. 血清样品采集与病毒分离鉴定 根据参考文献[5]进行。于实验第9天早上以股动脉放血方式采集所有狗血液样本，然后对血液样本进行处理获得血清，将血清分别接种到5个鸡胚中，每份血清20 μL。分别于接种后1～7d，取出鸡胚，判断胚体的死亡时间，计算鸡胚死亡时间的平均值，当孵化至20 d时，若胚体死亡时间平均值≤24 h，则判定该血清样品为病毒阴性;若胚体死亡时间平均值>24 h，则判定为病毒阳性。
4. 血清中和抗体检测 按照参考文献[6]的方法制备CCV标准毒株A12/HK-98 1 × 107 TCID50的鸡胚尿囊液，将其均匀涂布于直径为9 cm的培养皿上，室温放置待病毒完全干燥后将鸡胚放入37 ℃孵育箱内继续孵育至发病。收集存活鸡胚尿囊液，5 000 r/min，4 ℃离心5 min去除蛋浆沉淀，将获得的CEV作适当稀释后接种9～10日龄鸡卵母细胞，每个卵孔加100 μL病毒悬液，37 ℃孵育1h后加入等体积的无菌鸡胚胎血清，37 ℃继续孵化至30 h，弃去卵膜，收集卵黄液用于下一步检测。 按参考文献[7]制备等效浓度稀释梯度，以0.5%牛血清白蛋白(BSA)为对照，进行间接荧光抗体法(IFA)检测，确定CCV感染卵黄液的TCID50值。 以1：50倍系列稀释的血清样品作为抗体稀释液，100μL/孔依次稀释于96孔板中，每孔加入20μL的鸡胚尿囊液，同时设置空白对照(100 μL PBS/well)，于37℃孵育1 h使抗原充分暴露，弃去孔内液体，用无菌PBS洗涤，洗板次数≥3次;加入100 μL 1∶200稀释山羊抗犬gG二抗，37℃孵育30 min;重复上述洗涤步骤后再加入100μL 1∶5000稀释的山羊抗山羊IgG三抗，37 ℃再次孵育30 min;最后滴加50μL 1∶2 000 TMB底物溶液，室温避光显色15 min，终止反应后在酶标仪上测定OD450。 根据以下公式计算中和抗体效价： NTA=Dx10^n / Do， n代表抗体稀释倍数 ，Do表示阴性对照OD值。
5.